Základní principy faremní kultivace

Základní principy faremní kultivace – každý v současnosti používaný systém je z principu nepřesný a nenahradí profesionální laboratoř

Koncept faremní kultivace vznikl v USA na konci 80-tých let kdy vyvstala potřeba rozlišit dva základní „tábory“ původců mastitid. A sice se zde využilo pradávné, ale geniální rozdělení bakterií podle charakteristik jejich bakteriální stěny a tudíž i jejich barvitelnosti podle Grama. Toto rozdělení dle barvitelnosti (spíše domodra, nebo spíše dočervena) objevil Hans Christian Joachim Gram, dánský vědec, který tím v zásadě a možná nevědomky, rozdělil bakteriální říši na dvě skupiny bakterií, které, jak se časem ukázalo, mají spoustu společných zcela charakteristických vlastností. A o to právě šlo, mastitis způsobená G- bakteriemi probíhá zpravidla zcela jinak než pokud je původce ze skupiny G+. Klinicky to někdy rozeznat lze jindy ne. Kromě toho se G- mastitidy neléčí antibiotiky a jejich aplikace je zcela zbytečná z několika důvodů. A jelikož v USA činí dodnes podíl G- mastitid +/- 50% případů je jasné, pokud by se včas rozeznal původce ušetřilo by to nemalé náklady přímé finanční, ale i nepřímé na ztrátách mléka. A přesně to bylo cílem.

Kultivační média

První kultivační média, které je možno dodnes koupit, tedy rozlišují bakterie pouze na G+ a G-. Postupem času na misku přibylo ještě pole s krevním agarem, které má veledůležitou kontrolní funkci. A tato média jsou běžně dostupná i u nás.

Jejich určitou nevýhodou je, že člověku, který se mikrobiologií profesně nezabývá každý den připadají narostlé kolonie stejné, neboť se nebarví, s výjimkou těch G- bakterií které zkvašují laktózu (E.coli a spol.) a ty mají růžový až červený nádech. Označujme je proto jako nechromogenní média.

K dalšímu rozlišení již musíme ověřit jiné vlastnosti bakterií jako je například katalázová reakce s peroxidem vodíku, abychom rozlišili koaguláza pozitivní a negativní (CNS) stafylokoky. Rozlišit však jednotlivé druhy v rámci CNS je touto metodou nemožné. Pokud je na misce krevní agar přibývá nám jedna vrstva kontroly a můžeme ještě bakterie charakterizovat dle toho, zda tvoří hemolýzu (Staph. aureus v cca 50%), případně hydrolyzují přidaný eskulin (S. uberis a další viridující streptokoky, ale například i Staph. sciuri) apod. Krevní agar navíc umožňuje kontrolu, zda se jedná o kontaminovaný vzorek a v případě chromogenních půd lze na základě nárůstu na krevním poli odlišit i kontaminaci od hyperkeratozy struku, nebo odhalit přítomnost dlohorostoucích patogenů.

Přes určité limity jdou tedy tato média dodnes s úspěchem používat v praxi, neboť jsou uživatelsky velmi jednoduchá. Bohužel jen na relativně malém procentu chovů a předpokladem úspěšného používání je právě znalost těchto limitů.

S narůstající bakteriální rezistencí bylo nutné pomocí faremní kultivace rozpoznávat bakterie více detailněji, abychom léčbu dovedli lépe cílit a přestalo stačit pouhé zařazení patogena do příslušné skupiny, neboť i v rámci skupiny začaly bakterie vykazovat velikou variabilitu, obzvláště právě co se citlivosti vůči antibiotikům týká.

Řešením tedy bylo použití tzv. chromogenních médií.  Což sice umožňuje přesnější určení konkrétního druhu bakterie, ale na druhé straně to zásadně zkomplikovalo práci a správné užívání médií.

Chromogenita – alias ne každá modrá bakterie je uberis

V čem je problém? Princip chromogenity spočívá v tom, že se do agaru přidají chemikálie, které reagují s enzymy vylučovanými bakteriemi za vzniku barevného pigmentu. Barva se ve výsledku skládá podobně jako u barevné televize ze tří základních složek, tedy červené, zelené a modré. Naneštěstí je enzymatická výbava bakterií velmi variabilní a to i v rámci jednoho druhu, mohou tedy jednotlivé kmeny růst různými barvami (obr 1.).

 Až na několik výjimek se ale na chovu zpravidla vyskytuje pouze jeden kmen, takže dotyčná bakterie na konkrétním chovu roste pořád stejně až do doby, než se na farmu dostane kmen jiný který převáží a pak daný bakteriální druh, může změnit i barvu.

Nicméně, pokud je na médiu mnoho kolonií různých bakterií, blízko sebe, mohou se též barevně ovlivňovat a výsledná barva je neobvyklá. Dále pokud je bakteriální nálož velká, kolonie vypadají jinak než když jich je málo. (obr.2)  V současné době je opět jediným řešením tohoto problému velmi úzká spolupráce s laboratoří, která má přístroj zvaný MALDI-TOF a dovede bakterie typizovat.

Obr.č.2: Strep. uberis – různá bakteriální nálož a vzhled kolonií ve vzorcích, při stejném provedení (na médiu DCFC)

 

Jinými slovy – vždy když si nejste jistí co tam narostlo za monokulturu je třeba nechat vzorek přetestovat, aby se potvrdilo, že se skutečně díváte na to co si myslíte. Od toho se totiž pak odvíjí léčba a její úspěšnost.

Dalším znakem se kterým se musí pracovat při použití chromogenních agarů je určitý stupeň barevné nestálosti. Tedy pokud kultivujeme standartních 24 hodin vypadají kolonie nějak a mají nějakou barvu. Pokud to ale kultivujete déle, 36 nebo 48 hodin, vzhled kolonií se mění a částečně se mění i barva. Obr. 3

Pokud tedy chce (nebo musí) uživatel kultivovat na chromogenní agar, musí s tím takto pracovat aby byl úspěšný.

 

Text a foto: MVDr. Petr Slavík, Ph.D.

Jelikož je téma selektivního zaprahování více než aktuální, vznikl proto na jaře letošního roku cyklus seminářů na téma Produkce a reprodukce – dva základní pilíře úspěchu ve stáji  a zároveň zásadní výzvy na mléčné farmě pořádaný Zemědělským Svazem České republiky. Zásadní body  ze semináře týkající se produkce představíme v několika následujících příspěvcích.